EGRF remmers en effect bij longkanker: Groot wetenschappelijk achtergrond artikel over recente ontwikkelingen van EGRF remmers (Epidermale Groei Factor Receptor) bij de behandeling van longkanker. Door prof. dr. Giuseppe Giaconne

Aan dit artikel is enkele uren gewerkt. Opzoeken, vertalen, plaatsen enz. Als u ons wilt ondersteunen dan kan dat via een al of niet anonieme donatie. Elk bedrag is welkom hoe klein ook. Klik hier als u ons wilt helpen kanker-actueel online te houden Wij zijn een ANBI organisatie en dus is uw donatie aftrekbaar voor de belasting

6 juni 2012: we hebben dit artikel van prof. dr. Giaccone uit 2005 nog maar eens naar voren gehaald al zal er wellicht wel een en ander veranderd zijn. Maar de werking van EGRF remmers zal hetzelfde blijven nemen we aan. We halen dit artikel naar voren omdat recent nog ook bij longkanker bepaald is dat bepaalde receptoren op de tumoren nodig zijn voor effectief inzetten van bv. Tarceva en Iressa. Maar leest u dit artikel van dr. Giaccone.

23 december 2005: Marieke vertaalde dit grote wetenschappelijke achtergrond artikel over EGRF remmers voor ons, waarvoor heel veel dank. De auteur prof. dr. Giuseppe Giaccone is werkzaam in het VUMC Amsterdam. De co-auteur Jose Antonio Rodriguez is ook werkzaam in de VU. Ga hier aub zorgvuldig mee om en doe het altijd in overleg met uw arts als u iets met deze informatie wilt doen.

Opmerkelijk is in dit artikel dat het effect van EGRF remmers bij Aziatische longkankerpatiënten beduidend hoger ligt dan bij longkankerpatiënten levend in een westerse maatschappij. In Azië profiteert maar liefst 25% van EGRF remmers als Iressa en Tarceva, in het westen slechts 10%. Giaccone wijt dit aan een bepaalde genenstructuur die bij Aziatische mensen wel zou voorkomen en bij westerlingen niet. We hebben bepaalde engelse medische termen of uitspraken die we niet konden vertalen laten staan, maar wie voor bepaalde woorden nog een duidelijkere vertaling heeft voelen we ons aanbevolen. Onderaan staat het originele artikel.

EGFR-remmers: Wat hebben we geleerd van de behandeling van Longkanker?
Giuseppe Giaccone; Jose Antonio Rodriguez

Samenvatting
Tyrosine Kinase Inhibitors die werken tegen de Epidermale Groei Factor Receptor (EGFR) zijn de eerste op moleculen gerichte middelen die in de V.S. en andere landen moeten worden goedgekeurd voor de behandeling van gevorderde niet-klein-cellige longkanker na mislukking van chemotherapie. Sommige patiëntkenmerken zoals: nooit gerookt hebben, vrouw zijn, Oost-Aziatische afkomst, histologie van adenocarcinoma , en broncho-alveolair subtype, hangen samen met een groter profijt van behandeling met EGFR-remmers.
Recent onderzoek heeft genmutaties geïdentificeerd die inwerken op het kinasedomein van de EGFR, die gerelateerd zijn aan de respons op de remmers.

De meeste EGFR mutaties voorspellen een groter profijt van de behandeling in vergelijking met zogeheten wild-type-receptoren en zijn gecorreleerd aan klinische eigenschappen die samenhangen met een beter resultaat; sommige EGFR-mutaties echter leiden tot resistentie. De analyse van materiaal dat gewoonlijk beschikbaar is bij longkankerpatiënten, met gebruik van technieken zoals direct sequencing om de EGFR-mutatiestatus te bepalen, kan technisch uitdagend zijn. In dit verband kunnen hoge aantallen EGFR-copieën en EGFR-proteïnen die bij immunohistochemisch onderzoek worden ontdekt, ook worden gebruikt om die patiënten te selecteren die van behandeling zouden kunnen profiteren. Daartoe moet prospectieve validering van biologische en klinische gevoeligheidmarkers worden uitgevoerd

Inleiding
Longkanker is de belangrijkste oorzaak van aan kanker gerelateerde sterfte in de Westerse wereld en het mortaliteitscijfer stijgt snel in Azië; in het jaar 2002 was wereldwijd 1.2 miljoen kankersterfgevallen te wijten aan longkanker .[1 ]
Er zijn allereerst twee belangrijke soorten longkanker: niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en kleincellige longkanker. Meer dan 50% van de NSCLC patiënten is kandidaat voor systemische behandeling met chemotherapie, hetzij vanwege gevorderde ziekte, hetzij als adjuvante of neoadjuvante behandeling naast lokale therapie. Chemotherapie werkt echter matig bij NSCLC , en in de laatste paar jaar hebben verscheidene medicijnen die specifieker gericht zijn op doelen binnen de kankercel werkzaamheid bij NSCLC laten zien.[2 3 ]

Er zijn twee op moleculen gerichte stoffen erkend voor de behandeling van geavanceerde NSCLC: gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Wilmington, DE) en erlotinib (Tarceva®, OSI Pharmaceuticals Inc, Melville, NY). Beide middelen zijn kleine moleculen die behoren tot de klasse van de quinazolinaminen en die de tyrosine kinase van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmen door met ATP te concurreren voor de ATP-bindingsite.[4 ]
Naast deze twee tamelijk selectieve tyrosinekinaseremmers (TKIs) van EGFR, worden bij gevorderde NSCLC ook andere TKIs getest met een breder spectrum van werkzaamheid, en ook monoklonale antilichamen tegen het extracellulaire domein van de receptor worden daarvoor getest. [4 ]

Tot de breder spectrum TKIs behoren lapatinib en canertinib, die inwerken op meerdere leden van de familie van ErbB-receptoren , en ZD6474 en AEE788, die naast EGFR ook de vasculair-endotheliale groeifactor-receptor (VEGFR) verhinderen. Na mislukking van chemotherapie kunnen gefitinib en erlotinib bij ongeveer 10% van de blanke westerse patiënten met NSCLC tumoren een belangrijke respons veroorzaken, en bij ongeveer 25-30% van Japanse patiënten (gefitinib). De responscijfers van het monoklonale antilichaam tegen EGFR, cetuximab (Erbitux®, ImClone Systemen/Bristol-Myers Squibb), lijkt op vergelijkbare uitkomsten te wijzen, maar hiervan zijn nog geen ervaringen beschikbaar met Aziatische patienten.[4 )

Biologische Aspecten van EGFR-mutaties in samenhang met TyrosineKinase Inhibitor responsiviteit.

Een belangrijke doorbraak op het gebied van EGFR-gerichte therapie ontstond in 2004 met de identificatie van somatische veranderingen in het EGFR-gen, die sterk samenhingen met een gunstige klinische reactie van NSCLC patienten op de behandeling met gefitinib en erlotinib.[5,6,7 ] Deze genetische veranderingen bestonden uit KLEINE IN-FRAME MUTATIES OF PUNTMUTATIES IN EGFR- EXONEN 18-24, die het kinasedomein van de proteïne coderen en gegroepeerd zijn in twee mutationele ' hot spots' in het EGFR-gen. De vaakst ontdekte veranderingen waren kleine verwijderingen in exon 19 die de aminozuren 747-750 (Leu-Arg-Glu-Ala) elimineren, die zich bevinden rondom de actieve plaats van de kinase, en puntveranderingen in exon 21 die leiden tot in de aminozuursubstitutie van Leu858 naar Arg, een residu dat zich bevindt in het activeringscircuit.[5,6,7 ]

De in vitro analyse van de fenotypische effecten die samengaan met de expressie van mutante EGFR- proteïnen verschafte gegevens over de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de versterkte ontvankelijkheid voor gefitinib en erlotinib bij patiënten met NSCLC tumoren die EGFR mutaties hebben. De efficiency van deze medicijnen was significant hoger, in termen van het blokkeren van de activiteit van de receptor en het verminderen van de levensvatbaarheid van de cel, in die cellijnen die mutante EGFR-genen bezaten. Transfectie experimenten in van NSCLC afgeleide cellijnen[5,8,9 ] lieten zien dat, hoewel mutante EGFRs meer uitgesproken en aanhoudend activering op de ligandbinding ondergaan dan wild-typereceptoren, hun EGFR-activiteit efficiënter door gefitinib en erlotinib wordt geremd [6,7,8 ]. De moleculaire basis voor deze verschillende gevoeligheid van mutante EGFR-proteïnen moet nog worden vastgesteld, aangezien wild-type en mutante receptoren niet beduidend schijnen te verschillen in hun capaciteit om met deze inhibitors in vitro te interacteren. Belangrijk genoeg bleek het binden van ligand aan de mutante EGFRs te leiden tot selectieve activering van downstream signaling pathways die celoverleving bevorderen, zoals het eiwitkinase B (Akt) en de signaalomvormers en activatoren van transcriptie (STAT) pathways. [8,9]

De pro-overlevingssignalen die door deze downstream signaling moleculen worden overgebracht schijnen essentieel te zijn voor NSCLC cellen met mutante EGFR expressie, daar deze cellen massieve celdood ondergingen na farmacologische remming van de Akt en STAT signalering of RNA interference-mediated specifieke downregulering van de mutante receptor [8 ] Deze observaties wijzen erop dat de verhoogde doeltreffendheid van gefitinib en erlotinib bij NSCLC patiënten met EGFR mutaties op zijn minst voor een deel tot stand komt door de afbraak van de pro-overlevingssignalen waarvan de tumorcellen met een mutantereceptor afhankelijk zijn geworden .[8,11]

De Mutatie Status van EGFR als Voorspellende Marker van Tyrosine Kinase Remmer Respons.

De eerste studies die EGFR mutaties beoordeelden, selecteerden patiënten met opmerkelijke en langdurige respons.[5,6]. Mutaties werden het vaakst ontdekt in een sub-populatie van NSCLC-patiënten met kenmerken die samengingen met een beter behandelingsresultaat: vrouwen, niet rokers, patiënten van Japanse afkomst, en patiënten met adenocarcinoma histologie en in het bijzonder bronchio-oalveolair carcinoom.[4,12 ]. Het grootste thans beschikbare gegevensbestand van patiënten die met één enkel middel behandeld werden, stamt van de BR.21 studie, een gerandomiseerd onderzoek waarin erlotinib werd vergeleken met de beste palliatieve zorg bij patiënten met gevorderde NSCLC waarbij chemotherapie in eerste en/of tweede lijn gefaald had . Deze studie toonde aan dat erlotinib de overleving beduidend verbeterde, hoewel de respons slechts 8.8% was.[13 ]

Deze bescheiden respons zou niet alleen toe te schrijven zijn aan een dergelijke belangrijke overlevingswinst. Opgemerkt moet worden dat er bij een groot deel van de patiënten in deze studie sprake was van ofwel of een geringe respons ofwel stabiele ziekte; overwegend dat één van de belangrijkste effecten van EGFR-remmers die in preklinische studies werd waargenomen de capaciteit was om celproliferatie te verminderen [14 ], zou dit inderdaad een belangrijk effect kunnen zijn. In NSCLC cellijnen werd apoptosis slechts waargenomen wanneer zowel de extracellulaire signaal-geregelde kinase als de Akt- pathways door EGFR remming werden geblokkeerd, [14 ,15 ] terwijl dit in de meeste cellijnen niet mogelijk was en er slechts remming van proliferatie werd waargenomen. Van de 731 patiënten uit studie BR.21 werd bij 197 de EGFRstatus vastgesteld met gebruik van immunohistologisch onderzoek (IHC), fluorescentie in situ hybridization (FISH), en mutatie-analyse. In multivariate analyse hing de beoogde respons significant samen met adenocarcinoma histologie, nooit-gerookt status, en EGFR-expressie via IHC.[13 ].

Univariate analyse liet zien dat de overleving significant langer was in de erlotinib-groep wanneer de EGFR-expressie hoog was en de tumorcellen een groot aantal kopieën van EGFR-genen hadden, die via FISH waren ontdekt. Echter, de invloed van de EGFR status door om het even welk van de drie gebruikte methodes bepaald , bleek bij multivariate analyse niet significant. Deze studie veroorzaakt enige twijfel aan de geldigheid van de mutatie-status van EGFR als voorspeller van respons en overleving in grotere patiëntenpopulaties. In deze studie werd echter een groot aantal nog niet eerder gerapporteerde mutaties geïdentificeerd (24/45, 53%) . Daarom zouden deze gegevens misschien nader moeten worden geconfirmeerd, misschien door een cross-validation analyse. Ook de functionele implicaties van de nieuwe mutaties zouden moeten worden geconfirmeerd.

Het aantal patiënten die van anti-EGFR therapie profijt hadden in dit onderzoek[13 ] en andere grote klinische studies (16,17 ] overschreed het aantal NSCLC patiënten waarvan men op basis van het overwicht van EGFR mutaties dat werd vastgesteld in de eerdere onderzoeken, verwachtte dat zij een mutant EGFRgen bezaten. Ongeveer 40-50% van de patiënten in twee grote fase II studies van gefitinib liet klinische verbetering zien, hetgeen gelijk was aan het aantal patiënten met een goede respons plus stabiele ziekte [16,17 ]. Deze observaties wezen erop dat, hoewel de aanwezigheid van een EGFR mutatie een gunstige reactie op behandeling met gefitinib en erlotinib betrouwbaar kan voorspellen, een subgroep van patiënten die van deze medicijnen zouden profiteren, niet geselecteerd zou worden op basis van EGFR mutatiestatus . Het nauwe verband tussen de aanwezigheid van mutante EGFR genen en de klinische reactie op TKIs wordt consistent bevestigd (tabel 1). Echter, naarmate het aantal NSCLC patiënten die EGFR mutatie-analyse krijgen stijgt, wordt duidelijker dat een kleine, maar zichtbare, ondergroep van patiënten met mutaties geen response geeft op TKI behandeling.

Omgekeerd is het eveneens duidelijk, dat sommige patiënten die goed reageren op behandeling met gefitinib en erlotinib wild-type EGFRs hebben. Deze observaties zouden erop kunnen wijzen dat de procedures om de EGFR mutatiestatus te evalueren moeten worden geoptimaliseerd, en dat extra markers moeten worden vastgesteld om nauwkeurig elk van de NSCLC patiënten te kunnen identificeren die van anti-EGFR therapie kunnen profiteren . Net zoals bij bevindingen bij patiënten met gastro-intestinale stromale tumoren die mutaties in het C-KIT gen vertoonden, lijkt het erop dat bij NSCLC verschillende EGFR mutaties verschillende gevoeligheden voor TKIs kunnen oproepen.
In twee rapporten uit Azië (Taiwan en Japan), waar EGFR mutaties veel vaker voorkomen dan in de Westerse wereld, schijnen veranderingen in exon 19 van het EGFR gen vaker gevoeligheid te geven dan puntveranderingen in exonen 20 en 21.[18,19 ] Gegeven de relatieve zeldzaamheid van EGFR mutaties in blanke westerlingen is het momenteel moeilijk om deze bevindingen naar niet-Aziatische patiënten te vertalen.

Het Optimaliseren van de EGFR Mutatie Analyse
Er is gesteld dat de aanwezigheid van niet-ontdekte EGFR mutaties enkele van de gunstige reacties op TKIs zou kunnen verklaren die werden waargenomen bij NSCLC patiënten die kennelijk wild-type EGFRs dragen[12,20 ]. Ofschoon verscheidene van de NSCLC reeksen die op de aanwezigheid van EGFR mutaties worden geanalyseerd ofwel geheel ofwel gedeeltelijk bestaan uit bevroren weefselmonsters (vooral van geopereerde patiënten), is het meest voorkomende type weefsel dat voor analyse beschikbaar is, DNA dat uit met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels gehaald is. Als gevolg van de fixeringsprocedure leveren deze monsters gewoonlijk gedegradeerd DNA van slechte kwaliteit op, dat soms moeilijk te analyseren is. Aan de andere kant is er bij patiënten met gevorderde longkanker vaak slechts weinig diagnostisch materiaal beschikbaar, en het is vaak de cytologie die het moeilijk maakt om direct sequencing toe te passen wegens een ontoereikend aantal tumorcellen in de specimen. Daarbij komt nog dat wild-type EGFR DNA sequences van de normale cellen in het monster de aanwezigheid van mutaties kunnen maskeren. In dit verband bestaat er enig bewijs dat de meest gebruikte methode van de polymerase kettingreactie (PCR) amplificatie, gevolgd door direct sequencing, mogelijk niet mutaties zou kunnen ontdekken die wel kunnen worden geïdentificeerd met gebruik van een andere analysemethode, zoals SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM [21 ].

Bovendien zou de analyse kunnen worden verbeterd door gebruik van nieuwe technieken die gebaseerd zijn op het denatureren van hoogwaardige vloeibare chromatografie, hetgeen voor de opsporing van EGFR mutaties gevoeliger schijnt te zijn dan direct sequencing [22 ], evenals door het ontwikkelen van Methodes om specifiek de meest voorkomende soorten mutaties te bepalen, gebaseerd op eenvoudige PCR en beperking van enzymvertering.Voorts wijzen nieuwe gegevens erop dat het gebruik van LASER CAPTURE MICRODISSECTION om tumorcellen te selecteren zou kunnen leiden tot de identificatie van EGFR mutaties die niet op te sporen zijn als niet microscopisch verwijderd tumorweefsel wordt geanalyseerd [23 ]. De meeste van deze aanvullende procedures zijn echter technisch veeleisend en kunnen moeilijk te implementeren zijn in vele klinische laboratorium settings. Samenvattend: de mogelijkheid dat sommige EGFR mutaties moeilijk te ontdekken kunnen zijn met gebruikmaking van gemakkelijk te implementeren, technisch ongecompliceerde benaderingen benadrukt het belang van vaststelling van aanvullende voorspellende markers, in het bijzonder diegenen die niet afhankelijk zijn van op PCR gebaseerde analyse van DNA dat uit tumorweefsel wordt gehaald.

Aanvullende Markers om Respons op de EGFR Tyrosine Kinase Remmers bij NSCLC te voorspellen.

In andere op moleculen gerichte vormen van therapie, zoals de behandeling van uitgezaaide borstkanker met het anti-menselijke epidermale groeifactor receptor (anti-her2) antilichaam trastuzumab (Herceptin®, Genentech Inc., San Francisco, CA), is overexpressie van de doelproteïne (d.w.z. HER2) een kritieke marker die wordt gebruikt om patiënten te selecteren die van behandelingen met EGFR TKIs zullen profiteren.[24 ]. In tegenstelling hiermee wezen aanvankelijke studies onder NSCLC patienten erop dat het behandelingsresultaat van gefitinib bij patiënten die zowel HER2 als EGFR overexpressie vertoonden, niet verschilde in vergelijking met patienten die geen HER2 overexpressie hadden.[25,26). Gelijkwaardige resultaten werden verkregen in de eerste fase II studie van erlotinib (27). In een recenter rapport (28) werd de EGFR status bepaald door drie verschillende methoden te gebruiken: direct sequencing om de aanwezigheid van mutaties te onderzoeken, FISH om het aantal kopieen van het EGFR-gen vast te stellen, en IHC om de niveaus van de EGFR eiwitexpressie te evalueren. In deze studie werd ‘EGFR-Positiviteit ' in om het even welk van deze analyses significant geassocieerd met een betere reactie op gefitinib, maar een betere overleving werd slechts gevonden bij een groot aantal kopieen van het EGFR gen in multivariate analyse.

Deze resultaten zijn over het algemeen in overeenstemming met de resultaten die werden verkregen bij de met erlotinib behandelde patiënten in de BR.21 studie.[29) Consistente resultaten die de voorspellende waarde van het vaststellen van de kopieen van het EGFR gen ondersteunen, werden verkregen in onafhankelijke studies die ofwel FISH (30) ofwel een kwantitatieve PCR-vaststelling gebruikten. [23 ]. Opmerkelijk genoeg werd een significante correlatie gevonden tussen de aanwezigheid van EGFR mutaties en een hoog aantal van EGFR kopieen [23, 28, 31 ], hetgeen suggereert dat mutante allele van het EGFR gen selectief wordt vergroot in tumoren , zoals in mutante EGFR NSCLC cellijnen werd gezien.[9,23 ]. Hoewel potentieel interessanter, werd het verhoogde aantal kopieen van het gen gebaseerd op een scoringssysteem van zes categorieen door gebruik te maken van FISH analyse en een arbitraire cut-off waardering door tegengestelde PCR transcriptie. Deze analyses zullen bevestiging vergen in prospectieve studies en confirmatie door andere laboratoria.

Leden van de ErbB familie van receptoren (anders dan EGFR) die zouden kunnen 'heterodimerize' (?) met EGFR, zoals HER2, zijn ook onderzocht als potentiële voorspellende markers voor anti-EGFR therapie. Op dezelfde manier werden signalerende moleculen die stroomafwaarts van de EGFRroute functioneren, zoals K -ras en Akt, gedacht als voorspellende markers te functioneren.. Hoewel de respons op gefitinib onafhankelijk schijnt te zijn van het HER2 niveau , zoals bepaald door IHC [25 ], is toch onlangs bij NSCLC patienten de aanwezigheid gemeld van somatische veranderingen die de eiwitstructuur van het HER2 kinasedomein veranderen.[32,33). Deze mutaties bestaan uit kleine invoegingen en verdubbelingen die zich richten op een gebied van HER2 analoog aan exon 19 verwijderingen in het EGFR gen. HER2 mutaties schijnen frequenter voor te komen bij patiënten met klinische kenmerken die vergelijkbaar zijn met de sub-populatie van patiënten die EGFR mutaties dragen, maar opmerkelijk is dat zij nooit gelijktijdig met EGFR mutaties voorkomen. Het overwicht en de functionele relevantie van HER2 mutaties zou verder moeten worden onderzocht om hun waarde als markers voor anti-EGFR-therapie te bepalen .

Interessant is, dat mutaties in EGFR of HER2 genen wederzijds uitsluitend blijken te werken met K-ras mutaties.[34,35,36,37] .Verder wordt de aanwezigheid van K-ras mutaties geassocieerd met een gebrek aan response op behandeling met gefitinib and erlotinib. Daarom vormt de aanwezigheid van een K-ras gen mutatie, die bij ongeveer 30% van de NSCLC patienten wordt ontdekt waarschijnlijk een bruikbare marker om die patienten te selecteren die van een anti EGFR-therapie profijt zullen hebben. In een groot, gerandomiseerd onderzoek naar chemotherapie met of zonder erlotinib als eerstelijns therapie voor patienten met gevorderde NSCLC werden EGFR mutaties, die in 13% van de tumoren ontdekt werden, geassocieerd met, langere overlevingduur, ongeacht de behandeling..

K-ras mutaties, die in 21% van de tumoren werden ontdekt, werden geassocieerd met significant kortere tijd tot progressie en overlevingstijd bij patienten die behandeld waren met chemotherapie plus erlotinib. Deze resultaten wijzen erop dat EGFR mutatie mogelijk een positieve voorspellende factor voor overleving zou kunnen zijn, onafhankelijk van de behandeling met erlotinib, en dat de combinatie van EGFR remming met chemotherapie beter vermeden zou dienen te worden bij patienten met K-ras mutaties. Tenslotte werd gerapporteerd dat activering van Akt, vastgesteld middels IHC en phosphorylation-specifieke antilichamen, samenhing met een betere respons op gefitinib in vergelijking met de respons bij patienten die een negatieve score hadden op P-Akt (phosphorylated Akt). Er was een statistisch significant verband tussen een positieve P-Akt status en vrouwelijk geslacht, een voorgeschiedenis van niet-roken en een histologie van broncho-alveolair carcinoom, hetgeen suggereert dat de activering van deze route zou kunnen samenhangen met de aanwezigheid van EGFR mutaties. Daarbij moet echter worden opgemerkt dat een vaststelling van P-Akt bij afwezigheid van EGFR expressie zou kunnen wijzen op de transductie van een van EGFR onafhankelijk pro-overlevingssignaal, hetgeen een anti-EGFR therapie minder effectief zou kunnen maken.

In feite kan een P-Akt-positieve staining in 'EGFR-negatieve' NSCLC ( dwz. tumoren zonder mutatie of wijziging van het EGFR gen of met een lage EGFR eiwit- expressie) een slechter behandelingsresultaat voorspellen, , terwijl een positieve staining van P-Akt bij 'EGFR-positieve' gevallen (dwz. tumoren die een mutatie bevatten, of een hoog aantal genkopieen of hoge niveaus van EGFR eiwitten) een subgroep van patienten die bijzonder gevoelig zijn voor gefitinib zou kunnen aanwijzen. Samen geven deze resultaten aan dat de beslissing met betrekking tot behandeling met anti-EGFR medicijnen idealiter gebaseerd zou moeten zijn op een gecombineerd gebruik van verschillende markers die via verschillende technieken zouden moeten worden vastgesteld (bijv. PCR-direct sequencing, IHC, en FISH) met verschillende typen weefselmonsters (bijv. stukjes weefsel en uitgenomen DNA).

Secundaire Mutaties in het EGFR-gen en Verworven Weerstand tegen EGFR Remmers.

Naast de primaire resistentie tegen anti-EGFR therapie die samenhangt met de aanwezigheid van een K-ras mutatie [35 ], ontwikkelt zich uiteindelijk resistentie bij de meeste NSCLC patiënten die aanvankelijk responderen op gefitinib en erlotinib maar EGFR mutaties bezitten, hetgeen leidt tot voortschrijdende ziekte tijdens de behandeling. Verworven resistentie tegen EGFR remmers bleek samen te hangen met het voorkomen van een extra EGFR mutatie.[42,43 ]. Één studie beschrijft het voorkomen van een secundaire mutatie bij een patiënt met NSCLC na een succesvolle behandeling met gefitinib[43 ]. Terwijl de eerste mutatie, een verwijdering in exon 19, leidde tot gevoeligheid voor de behandeling , induceerde een tweede puntverandering in exon 20, die tot de substitutie van Thr790-naar-Met leidde, resistentie tegen verscheidene EGFR-remmers. Een andere groep identificeerde dezelfde Thr790-naar-Met mutatie bij twee van vijf patiënten met verworven resistentie tegen gefitinib of erlotinib[42 ], en bij een zesde patiënt de waarvan de tumor zich verder ontwikkelde bij adjuvante behandeling met gefitinib na volledige resectie. De mutatie kon niet worden ontdekt in onbehandelde tumormonsters. Biochemische analyse van transfected cellen en studies van de groeiremming met longkankercellijnen bevestigden dat de Thr790-naar-Met mutatie leidde tot resistentie in tumoren met EGFR mutaties die gewoonlijk gevoelig zijn voor gefitinib of erlotinib [42 ]. Twee rapporten uit Azië toonden aan dat de Thr790-naar-Met mutatie aanwezig kan zijn vanaf de diagnose en weerstand tegen EGFR TKIs bewerkstelligt.[44,45 ]

Deze bevindingen lijken sterk op de ervaring met imatinib bij gastro-intestinale stromal cel tumoren en chronische myeloide leukemie, waar secundaire veranderingen in respectievelijk de C-KIT en BCR-ABL genen samenhingen met een belangrijke oorzaak van verworven resistentie tegen imatinib.[46,47 ].

Interessant is, dat het EGFR-eiwit dat de tweede mutatie draagt, gevoelig was voor CL-387.785, een specifieke en onomkeerbare anilinoquinazoline TKI van EGFR, hetgeen suggereert dat de tweede generatie TKIs van EGFR een rol zou kunnen spelen bij de behandeling van NSCLC. In dit opzicht werden medicijnen die klinisch werden ontwikkeld voor de remming van tumoren die bestand zijn tegen gefitinib en erlotinib met twee EGFR mutaties (Leu858-naar-Arg en Thr790-naar-Met) in vitro onderzocht. Dit onderzoek identificeerde twee medicijnen, EKB-569 en CI-1033, die bredere spectrums voor leden van de ErbB familie hebben dan erlotinib en gefitinib, en toonde activiteit aan tegen de resistante mutant.. EGFR mutaties komen veel vaker voor in Oost Azië, waar de incidentie de 40% overschrijdt, en de hogere aanwezigheid van deze mutaties is gecorreleerd aan een hogere respons. Er is melding gemaakt van secundaire mutaties bij Aziaten, maar hun rol in het wijzigen van de gevoeligheid voor EGFR-remmers is nog niet opgehelderd[18,49 ]. Er is gerapporteerd dat schrappingen in exon 19 gevoelige tumoren nauwkeuriger zouden kunnen identificeren dan puntveranderingen, die bij sommige patiënten werden gevonden van wie de tumoren groeiden bij behandeling met gefitinib.[18 ]. Het is goed mogelijk dat sommige puntveranderingen die ontdekt werden in exonen 20 en 21 eerder resistentie dan gevoeligheid kunnen oproepen. Voorts voorspelt de aanwezigheid van mutaties in het gebied van de ATP-binding waarschijnlijk niet de respons op op anti-EGFR-therapie met gebruik van monoklonale antilichamen, zoals cetuximab.[50,51 ]. Interessant is dat onlangs is gerapporteerd dat twee patiënten respondeerden op gefitinib na mislukking van verscheidene chemotherapieen en cetuximab.[52 ] Deze bevinding zou erop kunnen wijzen dat monoklonale antilichamen en TKIs verschillende mechanismen van actie hebben en effectief zou kunnen worden gecombineerd om hun spectrum van activiteit te verbreden.

Selectie van patiënten voor behandeling met EGFR-Remmers

Het verband tussen EGFR mutaties en bijzondere patientkenmerken met betrekking tot gevoeligheid voor medicijnen, zoals vrouwelijk geslacht, adenocarcinoma histologie, nooit-gerookt status, en Aziatisch ras, is opvallend. Toch is een selectie van patiënten voor behandeling met deze middelen die alleen wordt gebaseerd op de aanwezigheid van EGFR mutaties controversieel, omdat niet alle patiënten die profijt hebben van de behandeling een mutatie herbergen, en enkele patienten met mutaties resistent zijn tegen TKIs. Het zou erop kunnen wijzen dat verwijderingsmutanten consistenter leiden tot gevoeligheid dan puntmutaties, die ook moeilijker zijn vast te stellen door direct sequencing. Anders dan verwijderingsmutaties kunnen sommige puntveranderingen de eiwitbouw beïnvloeden op een wijze die optimale enzymremming door EGFR TKIs verhindert. Bovendien zouden andere factoren, met inbegrip van versterking van het EGFR gen en de activiteit van moleculen downstream van EGFR, zoals P-Akt, en mutaties van K-ras, een rol kunnen spelen in de definitie van gevoeligheid voor EGFR-remmers. Op basis van beschikbare gegevens zou het beperken van de behandeling tot patiënten die een EGFR mutatie bezitten, niet kunnen worden gerechtvaardigd, hoewel patiënten met mutaties een zeer grote kans lijken te hebben op respons op behandeling met TKI. Het voorkomen van secundaire mutaties die de samenstelling van de ATP-binding pocket veranderen zou moeten worden onderzocht, en de ontwikkeling van tweede generatie EGFR-remmers die deze resistentie overwinnen is noodzakelijk.

Er dienen toekomstige klinische trials met patiënten die op basis van biologische kenmerken en/of klinische eigenschappen worden geselecteerd te worden uitgevoerd. Op het ogenblik zou het ongepast kunnen zijn om behandeling met een TKI uit te sluiten, alleen op basis van de mutatiestatus van EGFR. De vaststelling van patientkenmerken, zoals rokerstatus, geslacht en histologie, zou kunnen helpen bij de therapiekeuze voor patiënten met geavanceerde NSCLC. Een eerstelijnsbehandeling met een EGFR TKI bij patiënten met EGFR mutaties of bij patiënten die nooit gerookt hebben, vrouw zijn en adenocarcinoma histologie hebben, is zeker redelijk, ofwel als enig middel ofwel in combinatie met chemotherapie. Een EGFR TKI zou de voorkeur verdienen in tweede- en derdelijnstherapie bij patiënten met deze kenmerken, in plaats van chemotherapie, gezien het lagere giftigheidsprofiel en de eenvoudige toediening. Verscheidene studies die rekening houden met EGFR mutaties en klinische eigenschappen voor de selectie van patienten zijn nu aan de gang gezet of gepland. Gezien de verschijning van secundaire mutaties die leiden tot resistentie tegen TKIs, zouden klinische studies moeten proberen om herhaalde biopsieën op te nemen in een poging richting te geven aan de besluitvorming ten opzichte van de behandeling.

References
Parkin DM et al. (2005) Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 55: 74–108
Dubey S et al. (2005) Three emerging new drugs for NSCLC: pemetrexed, bortezomib, and cetuximab. Oncologist 10: 282–291
Herbst RS et al. (2005) Angiogenesis and lung cancer: prognostic and therapeutic implications. J Clin Oncol 23: 3243–3256
Giaccone G (2005) Epidermal growth factor receptor inhibitors in the treatment of non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 23: 3235–3242
Paez JG et al. (2004) EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304: 1497–1500
Lynch TJ et al. (2004) Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 350: 2129–2139
Pao W et al. (2004) EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 13306–13311
Sordella R et al. (2004) Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science 305: 1163–1167
Tracy S et al. (2004) Gefitinib induces apoptosis in the EGFRL858R non-small-cell lung cancer cell line H3255. Cancer Res 64: 7241–7244
Fabian MA et al. (2005) A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat Biotechnol 23: 329–336
Settleman J (2004) Inhibition of mutant EGF receptors by gefitinib: targeting an achilles' heel of lung cancer. Cell Cycle 3: 1496–1497
Janne PA et al. (2005) Epidermal growth factor receptor mutations in non-small-cell lung cancer: implications for treatment and tumor biology. J Clin Oncol 23: 3227–3234
Shepherd FA et al. (2005) Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 353: 123–132
Janmaat ML et al. (2003) Response to epidermal growth factor receptor inhibitors in non-small cell lung cancer cells: limited antiproliferative effects and absence of apoptosis associated with persistent activity of extracellular signal-regulated kinase or Akt kinase pathways. Clin Cancer Res 9: 2316–2326
Janmaat M et al. Enhanced cytotoxicity induced by gefitinib and specific inhibitors of the Ras or PI3K pathways in non-small cell lung cancer cells. Int J Cancer [doi: 10.1002/ijc.21290]
Fukuoka M et al. (2003) Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 21: 2237–2246
Kris MG et al. (2003) Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: a randomized trial. JAMA 290: 2149–2158
Chou TY et al. (2005) Mutation in the tyrosine kinase domain of epidermal growth factor receptor is a predictive and prognostic factor for gefitinib treatment in patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11: 3750–3757
Mitsudomi T et al. (2005) Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-smallcell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol 23: 2513–2520
Pao W and Miller VA (2005) Epidermal growth factor receptor mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions. J Clin Oncol 23: 2556–2568
Marchetti A et al. (2005) EGFR mutations in non-smallcell lung cancer: analysis of a large series of cases and development of a rapid and sensitive method for diagnostic screening with potential implications on pharmacologic treatment. J Clin Oncol 23: 857–865
Donohoe E (2005) Denaturing high-performance liquid chromatography using the WAVE DNA fragment analysis system. Methods Mol Med 108: 173–187
Takano T et al. (2005) Epidermal growth factor receptor gene mutations and increased copy numbers predict gefitinib sensitivity in patients with recurrent non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol [doi: 10.1200/ JCO.2005.01.0793]
Dressler LG et al. (2005) Comparison of HER2 status by fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry to predict benefit from dose escalation of adjuvant doxorubicin-based therapy in node-positive breast cancer patients. J Clin Oncol 23: 4287–4297
Cappuzzo F et al. (2003) Gefitinib in pretreated non-small-cell lung cancer (NSCLC): analysis of efficacy and correlation with HER2 and epidermal growth factor receptor expression in locally advanced or metastatic NSCLC. J Clin Oncol 21: 2658–2663
Parra HS et al. (2004) Analysis of epidermal growth factor receptor expression as a predictive factor for response to gefitinib ('Iressa', ZD1839) in non-smallcell lung cancer. Br J Cancer 91: 208–212
Perez-Soler R et al. (2004) Determinants of tumor response and survival with erlotinib in patients with non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 22: 3238–3247
Cappuzzo F et al. (2005) Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer. J NatlCancer Inst 97: 643–655
Tsao MS et al. (2005) Erlotinib in lung cancer— molecular and clinical predictors of outcome. N Engl J Med 353: 133–144
Hirsch FR et al. (2005) Increased epidermal growth factor receptor gene copy number detected by fluorescence in situ hybridization associates with increased sensitivity to gefitinib in patients with bronchioloalveolar carcinoma subtypes: a Southwest Oncology Group Study. J Clin Oncol [doi: 10.1200/ JCO.2005.01.2823]
Amann J et al. (2005) Aberrant epidermal growth factor receptor signaling and enhanced sensitivity to EGFR inhibitors in lung cancer. Cancer Res 65: 226–235
Stephens P et al. (2004) Lung cancer: intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours. Nature 431: 525–526
Shigematsu H et al. (2005) Somatic mutations of the HER2 kinase domain in lung adenocarcinomas. Cancer Res 65: 1642–1646
Kosaka T et al. (2004) Mutations of the epidermal growth factor receptor gene in lung cancer: biological and clinical implications. Cancer Res 64: 8919–8923
Pao W et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PLoS Med 2: e17
Soung YH et al. (2005) Mutational analysis of EGFR and K-RAS genes in lung adenocarcinomas. Virchows Arch 446: 483–488
Shigematsu H et al. (2005) Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers. J Natl Cancer Inst 97: 339–346
Rodenhuis S et al. (1988) Incidence and possible clinical significance of K-ras oncogene activation in adenocarcinoma of the human lung. Cancer Res 48: 5738–5741
Herbst RS et al. (2004) TRIBUTE—A phase III trial of erlotinib HCl (OSI-774) combined with carboplatin and paclitaxel (CP) chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) . J Clin Oncol 22 (Suppl 14): S619
Eberhard DA et al. (2005) Mutations in the epidermal growth factor receptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients with non-small-cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib. J Clin Oncol [doi: 10.1200/ JCO.2005.02.857
] Cappuzzo F et al. (2004) Akt phosphorylation and gefitinib efficacy in patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 96: 1133–1141
Pao W et al. (2005) Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PLoS Med 2: e73
Kobayashi S et al. (2005) EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 352: 786–792
Toyooka S et al. (2005) EGFR mutation and response of lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 352: 2136
Shih J-Y et al. (2005) EGFR mutation conferring primary resistance to gefitinib in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 353: 207–208
Chen LL et al. (2004) A missense mutation in KIT kinase domain 1 correlates with imatinib resistance in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 64: 5913–5919
Azam M et al. (2003) Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell 112: 831–843
Carter TA et al. (2005) Inhibition of drug-resistant mutants of ABL, KIT, and EGF receptor kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 11011–11016
Han SW et al. (2005) Predictive and prognostic impact of epidermal growth factor receptor mutation in non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. J Clin Oncol 23: 2493–2501
Lilenbaum R et al. (2005) A phase II trial of cetuximab as therapy for recurrent non-small cell lung cancer . J Clin Oncol 23: S629
Tsuchihashi Z et al: (2005) Responsiveness to cetuximab without mutations in EGFR. N Engl J Med 208–209
Raez LE et al. (2005) Clinical responses to gefinitib after failure of treatment with cetuximab in advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 23: 4244–4245
Huang SF et al. (2004) High frequency of epidermal growth factor receptor mutations with complex patterns in non-small cell lung cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan. Clin Cancer Res 10: 8195–8203
Kim KS et al. (2005) Predictors of the response to gefitinib in refractory non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11: 2244–2251
Tokumo M et al. (2005) The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res 11: 1167–1173
Mu XL et al. (2005) Gefitinib-sensitive mutations of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain in chinese patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11: 4289–4294
Cortes-Funes H et al. (2005) Epidermal growth factor receptor activating mutations in Spanish gefitinibtreated non-small-cell lung cancer patients. Ann Oncol 16: 1081–1086

Sidebar: Glossary
In-Frame Deletions: Mutations affecting three nucleotides that do not disrupt the translational reading frame of the DNA sequence; such mutations can, however, lead to the synthesis of an abnormal protein product

Point Mutations: Mutations that consist of the replacement (transition or transversion), addition, or deletion (frame-shift) of one nucleotide

Rna Interference: Use of double-stranded RNA to interfere with normal RNA processing, causing rapid degradation of endogenous RNA and precluding translation; a simple method of studying the effect of absence of a gene product

Single-Strand Conformation Polymorphism: The use of electrophoresis to separate single-stranded nucleic acids based on subtle differences in their DNA sequence, often a single base pair, which results in a different secondary structure and a measurable difference in mobility through a gel

Laser Capture Microdissection: A method for procuring pure cells from specific microscopic regions of tissue sections, which helps to automate and standardize microdissection

Reprint Address

Department of Medical Oncology, Vrije Universiteit Medical Center, 1117 De Boelelaan, HV 1081 Amsterdam, Netherlands e-mail van dr. Giaccone

G Giaccone is Head of the Department of Medical Oncology, and JA Rodriguez is a member of the Department of Medical Oncology at the Free University Medical Center, Amsterdam, Netherlands

Competing Interests: The authors declared they have no competing interests

Hier het originele artikel zoals gepubliceerd door Medscape.

EGFR Inhibitors: What Have We Learned From the Treatment of Lung Cancer? Posted 11/22/2005

Giuseppe Giaccone; Jose Antonio Rodriguez

Summary
Tyrosine kinase inhibitors directed against the epidermal growth factor receptor (EGFR) are the first molecular-targeted agents to be approved in the US and other countries for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer after failure of chemotherapy. Some patient characteristics, such as never-smoking, female gender, East Asian origin, adenocarcinoma histology, and bronchioloalveolar subtype, are associated with a greater benefit from treatment with EGFR inhibitors. Recently, studies have identified gene mutations targeting the kinase domain of the EGFR that are related to the response to inhibitors. Most EGFR mutations predict a higher benefit from treatment compared with wild-type receptors and are correlated with clinical features related to better outcome; some EGFR mutations, however, confer drug resistance. The analysis of material usually available from lung cancer patients, using techniques such as direct sequencing to determine EGFR mutational status, can be technically challenging. In this regard, high EGFR copy number and EGFR protein detected by immunohistochemistry can also be used to select those patients who would benefit from treatment. Prospective validation of biological and clinical markers of sensitivity needs to be performed.

Introduction
Lung cancer is the leading cause of cancer-related death in the Western world and the mortality rate is rapidly increasing in Asia; 1.2 million cancer deaths worldwide were from lung cancer in the year 2002.[1] There are primarily two major types of lung cancer: non-small-cell lung cancer (NSCLC) and small-cell lung cancer. More than 50% of NSCLC patients are candidates for systemic treatment with chemotherapy, either for advanced disease, or as adjuvant or neoadjuvant treatment, in addition to local therapy. Chemotherapy has, however, modest activity in NSCLC and, in the past few years, several drugs that are more specific for cancer cell targets have shown activity in NSCLC.[2, 3] There are two molecular-targeted agents approved for the treatment of advanced NSCLC: gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Wilmington, DE) and erlotinib (Tarceva®, OSI Pharmaceuticals Inc, Melville, NY). Both agents are small molecules that belong to the quinazolinamine class and inhibit the tyrosine kinase activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) by competing with ATP for the ATP-binding site.[4] Besides these two rather selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs) of EGFR, other TKIs with a broader spectrum of activity, and monoclonal antibodies to the extracellular domain of the receptor, are also being tested in advanced NSCLC.[4] Among broader spectrum TKIs are lapatinib and canertinib, which have activity on more members of the ErbB family of receptors, and ZD6474 and AEE788, which inhibit the vascular endothelial factor receptor in addition to EGFR. After failure of chemotherapy, gefitinib and erlotinib are able to induce major objective responses in approximately 10% of Caucasian patients and 25-30% of Japanese patients (gefitinib) with NSCLC tumors. The response rate to the EGFR monoclonal antibody cetuximab (Erbitux®, ImClone Systems/Bristol-Myers Squibb) appears similar in the same setting, but no experience is available in Asian patients.[4]

Biological Aspects of EGFR Mutations Associated With Tyrosine Kinase Inhibitor Responsiveness A major breakthrough in the field of EGFR-targeted therapy was seen in 2004 with the identification of somatic mutations in the EGFR gene, which were closely associated with a favorable clinical response to gefitinib and erlotinib treatment in NSCLC patients.[5,6,7] These genetic alterations consisted of small IN-FRAME DELETIONS or POINT MUTATIONS in EGFR exons 18-24, which encode the kinase domain of the protein and are clustered in two mutational 'hot spots' in the EGFR gene. The most frequently detected alterations were small deletions in exon 19 that eliminate amino acids 747-750 (Leu-Arg-Glu-Ala), located around the active site of the kinase, and point mutations in exon 21 that result in the amino acid substitution Leu858Arg, a residue located in the activation loop.[5,6,7]

The in vitro analysis of the phenotypic effects associated with the expression of mutant EGFR proteins provided information on the molecular and cellular mechanisms underlying the enhanced responsiveness to gefitinib and erlotinib in patients with NSCLC tumors that have EGFR mutations. The efficiency of these drugs was significantly higher, in terms of blocking the activity of the receptor and decreasing cell viability, in those cell lines harboring mutant EGFR genes. Transfection experiments in NSCLC-derived cell lines[5,8,9] revealed that, although mutant EGFRs undergo more pronounced and sustained activation upon ligand binding than the wild-type receptors, their EGFR activity is more efficiently inhibited by gefitinib and erlotinib.[6,7,8] The molecular basis for such different sensitivity of mutant EGFR proteins remains to be established, as wild-type and mutant receptors do not appear to differ significantly in their ability to interact with these inhibitors in vitro. Importantly, binding of the ligand to the mutant EGFRs was shown to result in the selective activation of downstream signaling pathways that promote cell survival, such as the protein kinase B (Akt) and the signal transducers and activators of transcription (STAT) pathways.[8,9] The pro-survival signals transduced by these downstream signaling molecules appear to be essential for NSCLC cells that express mutant EGFRs, as these cells underwent massive cell death after pharmacologic inhibition of the Akt and STAT signaling or RNA INTERFERENCE-mediated specific downregulation of the mutant receptor.[8] These observations indicate that the increased efficacy of gefitinib and erlotinib in NSCLC patients bearing EGFR mutations Results, at least in part, from the abrogation of the pro-survival signals on which the tumor cells expressing a mutant receptor have become dependent.[8,11]

EGFR Mutational Status as a Predictive Marker of Tyrosine Kinase Inhibitor Response The initial studies that assessed EGFR mutations selected patients with striking and long-lasting responses.[5,6] Mutations were most frequently detected in a subpopulation of NSCLC patients with characteristics associated with a better treatment outcome: women, non-smokers, patients of Japanese origin, and patients with adenocarcinoma histology and, in particular, bronchioloalveolar carcinoma.[4,12] The largest database currently available of patients treated with a single agent is from the BR.21 study, a randomized trial where erlotinib was compared with best supportive care in patients with advanced NSCLC who had failed one or two lines of chemotherapy. This study demonstrated that erlotinib significantly improved survival, although the response rate was only 8.8%. This modest response rate might not be solely attributable to such an important survival gain. It should be noted that a large proportion of patients in this study had either a minor response or stable disease; considering that one of the major effects of EGFR inhibitors observed in preclinical studies was the ability to reduce cell proliferation, this might indeed be an important effect. In NSCLC cell lines, apoptosis was only observed when both the extracellular signal-regulated kinase and the Akt pathways were blocked by EGFR inhibition,[14,15] whereas in most cell lines this was not possible and only inhibition of proliferation was observed. Of the 731 patients included in the BR.21 study, 197 were assessed for EGFR status using immunohistochemistry (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH), and mutation analysis. In multivariate analysis, objective response was significantly associated with adenocarcinoma histology, never-smoking status, and expression of EGFRs by IHC. Univariate analysis showed that survival was significantly longer in the erlotinib arm when EGFR expression was high and tumor cells had a high number of copies of EGFR genes, detected by FISH. However, the influence of the EGFR status determined by any of the three Methods used was not significant by multivariate analysis. This study casts some doubts on the validity of the mutational status of EGFR as a predictor of response and survival on larger populations of patients. In this study, however, a large number of mutations were identified (24/45, 53%) that were previously unreported. These data, therefore, might need further confirmation, perhaps by carrying out a cross-validation analysis. The functional implications of the novel mutations should also be confirmed.

The proportion of patients who benefited from anti-EGFR therapy in this study and other large clinical studies[16,17] exceeded the proportion of NSCLC patients expected to harbor a mutant EGFR gene, based on the prevalence of EGFR mutations determined in the initial analyses. Approximately 40-50% of patients in two large phase II studies of gefitinib derived clinical benefit, which was similar to the number of patients who experienced a major response plus stable disease.[16,17] These observations indicated that, although the presence of an EGFR mutation can reliably predict a favorable response to gefitinib and erlotinib treatment, a subset of patients who would benefit from these drugs would not be selected on the basis of EGFR mutational status.

The close relationship between the presence of mutant EGFR genes and the clinical response to TKIs has been consistently confirmed ( Table 1 ). However, as the number of NSCLC patients undergoing EGFR mutation analysis increases, it has become clearer that a small, but sizable, subset of patients with mutations do not respond to TKI treatment. Conversely, it is also evident that some patients who respond to gefitinib and erlotinib therapy have wild-type EGFRs. These observations might suggest that procedures for evaluating EGFR mutational status need to be optimized, and additional markers need to be established to accurately identify all of the NSCLC patients who can benefit from anti-EGFR therapy. Similar to findings in patients with gastrointestinal stromal tumors that displayed mutations in the gene C-KIT, it appears that different EGFR mutations might confer different sensitivities to TKIs in NSCLC. In two reports from Asia (Taiwan and Japan), where the incidence of EGFR mutations is much higher than in the Western world, mutations in exon 19 of the EGFR gene appear to confer sensitivity more often than point mutations in exons 20 and 21.[18,19] Given the relative infrequency of EGFR mutations in Caucasians, it is difficult at present to extend these findings beyond Asian patients.

Optimizing EGFR Mutation Analysis
It has been postulated that the presence of undetected EGFR mutations might explain some of the favorable responses to TKIs observed in NSCLC patients bearing seemingly wild-type EGFRs.[12,20] Although several of the NSCLC series analyzed for the presence of EGFR mutations consist, wholly or in part, of frozen tissue samples (especially from resected patients), the most common type of sample available for analysis is DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. As a result of the fixation procedure, these samples usually yield low-quality, degraded DNA that can be difficult to analyze. On the other hand, in patients with advanced lung cancer, often only small diagnostic material is available, and it is often cytology that makes it difficult to implement direct sequencing, because of insufficient number of tumor cells present in the specimens. In addition, wild-type EGFR DNA sequences from the normal cells in the sample can mask the presence of mutations. In this regard, there is some evidence that the most commonly used method of polymerase chain reaction (PCR) amplification followed by direct sequencing might not detect mutations that can be identified using a different analysis method, such as SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM. Furthermore, the analysis could be improved by the use of novel techniques based on denaturing high-performance liquid chromatography, which appear to be more sensitive than direct sequencing for the detection of EGFR mutations, as well as by developing Methods to specifically determine the most prevalent types of mutations based on simple PCR and restriction enzyme digestion. Moreover, novel data indicate that the use of LASER CAPTURE MICRODISSECTION to select tumor cells might lead to the identification of EGFR mutations that are undetectable when the non-microdissected tumor tissue is analyzed. However, most of these additional procedures are technically demanding and might be difficult to implement in many clinical laboratory settings. In summary, the possibility that some EGFR mutations might be difficult to detect using easy-to-implement, technically straightforward approaches highlights the importance of establishing additional predictive markers, in particular those that would not depend on PCR-based analysis of DNA extracted from tumor tissue.

Additional Markers to Predict Response to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors in NSCLC In other molecular-targeted approaches to therapy, such as the treatment of metastatic breast cancer with the anti-human epidermal growth factor receptor (anti-HER2) antibody trastuzumab (Herceptin®, Genentech Inc., San Francisco, CA), overexpression of the target protein (i.e. HER2) is a critical marker that is used to select patients who will benefit from treatment using EGFR TKIs. In contrast, initial studies on NSCLC patients indicated that gefitinib treatment outcome was no different in patients who overexpressed both HER2 and EGFR, compared with those who had no HER2 overexpression.[25,26] Similar Results were obtained in the first phase II study of erlotinib. In a more recent report, EGFR status was determined by using three different Methods: direct sequencing to investigate the presence of mutations, FISH to assess EGFR gene copy number, and IHC to evaluate EGFR protein expression levels. In this study, 'EGFR-positivity' in any of these assays was significantly associated with a better response to gefitinib, but a better survival was found to be significantly associated only with a high EGFR gene copy number in multivariate analysis. These Results are, generally, in concordance with the Results obtained in erlotinib-treated patients in the BR.21 study. Consistent Results supporting the predictive value of determining EGFR gene copy number in gefitinib-treated patients have been obtained in independent studies using either FISH or a quantitative PCR assay. Interestingly, a significant correlation between the presence of EGFR mutations and a high EGFR gene copy number was seen,[23,28,31] suggesting that the mutant allele of the EGFR gene is selectively amplified in tumors, as it has been observed in EGFR-mutant NSCLC cell lines.[9,23] Although potentially more appealing, the increased gene copy number was based on a six-category scoring system using FISH analysis and an arbitrary cut-off value by reverse transcription PCR. These assays will need validation in prospective studies and confirmation by other laboratories.

Members of the ErbB family of receptors (other than EGFR) that might heterodimerize with the EGFR, such as HER2, have also been investigated as potential predictive markers for anti-EGFR therapy. Similarly, signaling molecules that function downstream of the EGFR pathway such as K-ras and Akt, have been implicated to function as predictive markers. Although the response to gefitinib appears to be independent of HER2 levels, as determined by IHC, the presence of somatic mutations that alter the protein structure of the HER2 kinase domain has been recently reported in NSCLC patients.[32,33] These mutations consist of small insertions and duplications that target a region of HER2 analogous to exon 19 deletions in the EGFR gene. HER2 mutations seem to be more frequent in patients with clinical characteristics similar to the subpopulation of patients bearing EGFR mutations but, remarkably, they never occur simultaneously with EGFR mutations. The prevalence and functional relevance of HER2 mutations should be investigated further to determine their value as markers for anti-EGFR therapy.

Interestingly, mutations in EGFR or HER2 genes have been found to be mutually exclusive with K-ras mutations.[34,35,36,37] Furthermore, the presence of K-ras mutations is associated with a lack of treatment response to gefitinib and erlotinib. Therefore, the presence of a K-ras gene mutation, which is detected in approximately 30% of NSCLC, is likely to constitute a useful marker for selecting those patients who will not benefit from anti-EGFR therapy. In a large, randomized study of chemotherapy with or without erlotinib as first-line therapy for advanced NSCLC patients,EGFR mutations, detected in 13% of tumors, were associated with longer survival irrespective of treatment.K-ras mutations, detected in 21% of tumors, were associated with significantly decreased time to progression and survival in patients treated with erlotinib plus chemotherapy. These Results suggest that EGFR mutation might be a positive prognostic factor for survival, independent of treatment with erlotinib, and that the combination of EGFR inhibition with chemotherapy should be avoided in patients with K-ras mutations. Finally, it was reported that activation of Akt, determined using IHC and phosphorylation-specific antibodies, was associated with a better response to gefitinib compared with the response in patients who were negative for P-Akt (phosphorylated Akt). There was a statistically significant association between P-Akt positivity status and female gender, a history of never-smoking, and with bronchioloalveolar carcinoma histology, suggesting that the activation of this pathway might be associated with the presence of EGFR mutations. It should be noted, however, that detection of P-Akt in the absence of EGFR expression could represent the transduction of an EGFR-independent pro-survival signal, which might render anti-EGFR therapy less effective. In fact, P-Akt-positive staining in 'EGFR-negative' NSCLC (i.e. tumors lacking mutation or amplification of the EGFR gene or expressing low levels of EGFR protein) could predict a worse treatment outcome, whereas P-Akt-positive staining in 'EGFR-positive' cases (i.e. tumors containing a mutation, high gene copy number, or high EGFR protein levels) could identify a subgroup of NSCLC patients particularly sensitive to gefitinib. Collectively, these Results indicate that the decision regarding treatment with anti-EGFR agents should ideally be based on the combined use of several markers that would be evaluated using different techniques (e.g. PCR-direct sequencing, IHC, and FISH) in different types of samples (e.g. tissue sections and extracted DNA).

Secondary Mutations in the EGFR Gene and Acquired Resistance to EGFR Inhibitors In addition to the primary resistance of anti-EGFR therapy associated with the presence of K-ras mutation, resistance eventually develops in most NSCLC patients who initially responded to gefitinib and erlotinib but harbor EGFR mutations, leading to disease progression during treatment. Acquired resistance to EGFR inhibitors has been shown to be associated with the occurrence of an additional EGFR mutation.[42,43] One study described the occurrence of a secondary mutation in a patient with NSCLC following successful gefitinib treatment. While the first mutation, a deletion in exon 19, conferred sensitivity to the treatment, a second point mutation in exon 20, leading to the substitution Thr790Met, induced resistance to several EGFR inhibitors. Another group identified the same Thr790Met mutation in two of five patients with acquired resistance to gefitinib or erlotinib and a sixth patient whose tumor progressed when treated with adjuvant gefitinib after complete resection. The mutation could not be detected in untreated tumor samples. Biochemical analysis of transfected cells and growth inhibition studies with lung cancer cell lines confirmed that the Thr790Met mutation conferred resistance in tumors with EGFR mutations that are usually sensitive to gefitinib or erlotinib. Two reports from Asia demonstrated that the Thr790Met mutation can be present from diagnosis and confer resistance to EGFR TKIs.[44,45]

These findings closely resemble the experience with imatinib in gastrointestinal stromal cell tumors and chronic myeloid leukemia, where secondary mutations in the C-KIT and BCR-ABL genes, respectively, have been associated with a major cause of acquired resistance to imatinib.[46,47] Interestingly, the EGFR protein bearing the second mutation was sensitive to CL-387,785, a specific and irreversible anilinoquinazoline TKI of EGFR, suggesting that second-generation TKIs of EGFR might have a role in the treatment of NSCLC. In this respect, agents undergoing clinical development for inhibition of the gefitinib-resistant and erlotinib-resistant tumors with two EGFR mutations (Leu858Arg and Thr790Met) were screened in vitro. This screening identified two drugs, EKB-569 and CI-1033, which have broader spectrums for ErbB family members than erlotinib and gefitinib, and showed activity against the resistant mutant.EGFR mutations are much more frequent in East Asia, where the incidence exceeds 40%, and the higher incidence of these mutations is correlated with a higher response rate. Secondary mutations have been reported in Asians, but their role in modifying sensitivity to EGFR inhibitors has not yet been elucidated.[18,49] It has been reported that deletions in exon 19 might more accurately identify sensitive tumors than point mutations, which were found in some patients whose tumors progressed on treatment with gefitinib. It is quite possible that some point mutations detected in exons 20 and 21 might confer resistance rather than sensitivity. Moreover, the presence of mutations in the ATP-binding site probably does not predict response to anti-EGFR therapy using monoclonal antibodies, such as cetuximab.[50,51] Interestingly, it has recently been reported that two patients responded to gefitinib after failure of several chemotherapy regimens and cetuximab. This finding could indicate that monoclonal antibodies and TKIs have different mechanisms of action and might be effectively combined in order to broaden the